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BOSHY 荧光探针实验操作手册
适用产品： OmiFluo™ BOSHY-LD Yellow, OmiFluo™ BOSHY-LD Green
版本： v1.0 | 日期： 2026-01-08
1. 储备液制备
为了确保最佳的实验重复性，请严格按照以下步骤制备储备液。
- 配方： 准确称取 1.0 mg OmiFluo™ BOSHY-LD Yellow (MW≈670) 或等量 OmiFluo™ BOSHY-LD Green。
- 溶解： 加入 298.5 μL 无水 DMSO。
- 混合： 充分涡旋直至完全溶解。
- 成品： 获得 5 mM 储备液。
⚠️ 保存注意事项： 储备液需避光，于 -20℃ 保存。有效期约 6 个月。工作液必须现用现配，严禁反复冻融。
2. 细胞染色步骤
Day 1: 细胞铺板
- 将 HeLa 或相关细胞系接种于 35 mm 共聚焦专用培养皿 (Confocal Dish)。
- 接种密度：2-5×10⁴ cells/mL，每皿 1.5 mL。
- 培养条件：37°C，5% CO₂ 培养 24 小时，至细胞融合度达到 60-70%。
Day 2: 染色与成像
步骤 1: 工作液配制
- 取 2 μL 的 5 mM 储备液加入 998 μL 无血清培养基中。
- 轻柔混匀，得到 10 μM 中间液（避免剧烈涡旋以防析出）。
- 再次用预温的培养基 1:10 稀释，最终获得 1 μM 工作液。
步骤 2: 细胞染色
- 吸弃旧培养基，用预温的 PBS 轻柔洗涤 1 次。
- 加入 1 mL 1 μM 染色工作液。
- 放入 37°C 培养箱，避光孵育 20 分钟。
- 吸弃染色液，用预温 PBS 洗涤 2 次（每次 1 mL，1 分钟）。
- 加入 1 mL 新鲜完全培养基（不含酚红效果更佳）。
3. 共聚焦成像设置
推荐使用 Zeiss LSM 880 或同等规格共聚焦显微镜。
| 参数 |
设置建议 |
| 物镜 |
63× 油镜 (NA=1.4) |
| 激发波长 |
488 nm (Argon 激光，功率建议 5-10%) 或 405 nm |
| 发射收集 (OmiFluo™ BOSHY-LD Yellow) |
520 - 620 nm (绿色/黄色通道) |
| 发射收集 (OmiFluo™ BOSHY-LD Green) |
500 - 550 nm |
| 分辨率 |
1024×1024 像素，12-bit 深度 |
提示： BOSHY 探针具有较大的斯托克斯位移，请确保发射及收集波段设置正确，以获得最佳信噪比。
4. 多色成像参考方案
- 单标脂滴： OmiFluo™ BOSHY-LD Yellow + DAPI (核染)。
- 脂滴 + 线粒体： OmiFluo™ BOSHY-LD Yellow (488 ex) + MitoTracker Red (561 ex)。
- 脂滴 + 溶酶体： OmiFluo™ BOSHY-LD Yellow (488 ex) + LysoTracker Red (561 ex)。
5. 数据定量分析 (ImageJ/FIJI)
推荐使用 ImageJ/FIJI 软件按照以下流程进行脂滴参数定量：
步骤 1: 图像预处理
- 背景扣除： Process > Subtract Background (Rolling ball radius = 50 pixels)。
- 降噪： Process > Filters > Gaussian Blur (Sigma = 1.5)。
步骤 2: 阈值分割
- 自动阈值： Image > Adjust > Threshold (选择 Li's 算法)。
- 二值化： Apply 生成二值图像。
步骤 3: 参数提取
- Analyze > Analyze Particles。
- 设置： Size > 0.2 μm² (排除杂质)，勾选 "Summarize"。
- 输出指标： 脂滴数量 (Count)、平均面积 (Average Size)、总面积占比 (%Area)。
步骤 4: 特异性验证 (可选)
- 若进行双色共染，使用 Coloc 2 插件计算 Pearson 系数 (R)。
- R > 0.90 视为特异性良好。